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人凝血酶原复合物分离纯化技术推陈出新
2006年6月20日 9:39  来源:中国医药报  作者:邱家山 方为茂

   近年来,随着我国肝炎发病率的增加,以及临床医师对人凝血酶原复合物(PCC)制剂治疗效果的认同,PCC制剂被大量应用于临床肝脏出血的患者,需求量逐年增加。PCC包括凝血因子II(凝血酶原)、VII(稳定因子)、IX(抗乙型血友病因子)、X(自身凝血酶III)。现有的PCC分离纯化方法主要为直接从血浆中用凝胶吸附和低温乙醇沉析并经凝胶吸附,其中直接从血浆中用凝胶吸附的方法又分为经典的批式吸附法和半流动吸附法。由于血浆中抑制凝血因子活化的一些天然抑制剂会被乙醇所灭活,从而使凝血因子活化,所以目前大多数血液制品生产企业采用直接从血浆或去冷沉淀的血浆中用凝胶吸附的方法制备PCC。但是,PCC制剂中含有部分杂蛋白,尤其是被激活的因子Xa、IXa、VIIa等,临床输注偶可诱发弥散性血管内凝血(DIC)和血栓并发症。为避免这一问题,需要进一步改进分离纯化工艺。可喜的是,近年来,随着现代生物分离纯化技术的发展,出现了一些新型单元分离技术,如亲和层析法、逆胶束法、扩张床吸附技术(EBA)、双水相分配技术等,其中最为成功的扩张床吸附技术已被应用于工业规模的生产。

    ▲批式吸附法:操作麻烦且成本较高

    经典的批式吸附法经荷兰红十字会输血中心Heysteck等人提出,后经Brumm-elhuis等人完善后被用于大规模制备PCC。具体工艺为:血浆(去冷沉淀上清)加DEAE-SephadexA50(1~1.5克干重/升血浆),在10℃~15℃下搅拌45分钟;去离心分离出的上清,进一步分离其他血浆蛋白,分离出的凝胶用pH值7.0、含0.01摩尔/升枸橼酸钠的0.2摩尔/升的氯化钠溶液洗涤3次,将洗液废弃(此过程会造成凝血因子II约20%的损失);再用pH值7.0、含0.015摩尔/升枸橼酸钠的2.0摩尔/升的氯化钠溶液洗脱两次;洗脱液经SephadexG-25凝胶过滤脱盐后,加入0.3%磷酸三丁酯和1%吐温80经24℃~26℃、6小时病毒灭活;最后经除菌过滤后,分装、冻干得成品。通常在PCC制备的最后阶段前,要加入肝素或肝素与抗凝血酶III,以防止或减少凝血因子活化。但是,该工艺存在明显的缺点:吸附是在搅拌罐内进行,由于凝胶的机械强度不高,所以凝胶的破损率大,生产成本高;PCC经批式吸附后,洗涤和洗脱需在柱内进行,操作麻烦,易产生交叉污染,血浆处理量受到限制。

    ▲半流动法:控制简单、吸附能力较强

    为克服经典批式吸附法的缺点,美国红十字会Holland实验室的Tharakan等开发了一种半流动方法,即用离子交换吸附剂从去冷沉淀血浆中制备PCC。该方法采用一个带搅拌功能的圆柱,而无需手工操作,可增加血浆与凝胶的接触,减少总的操作时间。

    具体工艺为:将DEAE-SephadexA50用0.85摩尔/升的氯化钠溶液溶胀,淘洗出细小颗粒,加入与凝胶等体积量的0.075摩尔/升的氯化钠溶液,121℃灭菌30分钟;将准备好的850克凝胶灌进圆柱,经0.8微米的筒式滤器泵入去冷沉淀的血浆50升;搅拌25分钟,以2升/分钟的速度放出血浆;用0.07摩尔/升枸橼酸钠的(pH值为6.0)溶液悬浮洗涤60分钟,洗两次;然后用0.2摩尔/升枸橼酸钠(pH值6.0)溶液洗脱PCC;其余过程同经典批式吸附法。

    与批式吸附法不同的是,半流动法中血浆与离子交换剂在圆柱体内连续流动混合,未吸附血浆的去除过程包含在吸附过程中,洗涤、洗脱在同一容器内,因此过程控制简单,并较经典方法可显著地改进凝胶吸附凝血因子II和凝血因子IX的能力。研究表明,批式吸附法和半流动法中凝血因子II、凝血因子IX、凝血因子X的活性回收率分别为27.6%和60%,49.1%和68%,51.2%和57.1%,所以半流动法优于批式吸附法。

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