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人禽流感疫苗研究热门技术:反向遗传技术

2009/1/21/11:06 来源:生物通

    近期人禽流感疫情频繁,国人对禽流感的关注度也日渐升高,呼吁人用禽流感疫苗的呼声恐怕也越来越强烈。

    生物通小编为您解析国际上最流行的禽流感疫苗制作技术:反向遗传技术。这项技术不仅在兽用禽流感疫苗的研究上发挥巨大的作用,还在人用禽流感疫苗的研究上占有举足轻重的地位。据悉,我国自主研发的人用禽流感疫苗也是用的反向遗传操作技术来进行的。

    流感病毒的反向遗传操作技术从1989年创始到现在,共有19年的发展历程。在这将近20年里,此项技术不断地被改进,为流感病毒的研究提供了极为先进和便利的工具和条件。反向遗传技术就是利用现代生物技术体外合成病毒的技术,因而可以体外操作病毒的各基因片段。

    禽流感病毒是单链负股RNA病毒,关于RNA病毒的反向遗传操作技术。RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝,使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型,可以在体内(invivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。自1978年第一例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展。该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子,并使之受控于RNA聚合酶启动子,通过体外转录过程再次得到病毒RNA,然后将该转录物RAN转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒,由于这种拯救病毒是来自全长cDNA分子,因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒基因组表达调控机制,病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株,开发新型的疫苗。目前已有许多RNA病毒的全长感染性cDNA克隆构建成功。

    禽流感病毒的反向遗传操作

    禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成。

    操作步骤:

    一、首先用RT-PCR技术分别扩增禽流感病毒的8个基因片段的cDNA,在分子水平进行操作修饰

    二、将cDNA克隆于合适的载体上,使之受控于强的转录启动子之下(目前禽流感流行的有8质粒系统和12质粒系统)

    三、在体外应用RNA聚合酶转录系统,合成病毒基因组的RNA

    四、再用这些体外转录本转染宿主细胞(转染鸡成纤维细胞),使之在宿主细胞内包装生成具有感染性的病毒粒子

    五、从细胞培养物中回收病毒,得到感染性分子克隆

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